第二章 生物材料的预处理和细胞破碎及固液分离

  微生物或动植物细胞在合适的培养基，ＰＨ值， 温度和通气搅拌（或厌气）等发酵条件下进行生长 和合成生物活性物质，因为在其培养（发酵）液中 包含了菌（细胞）体，胞内外代谢产物，胞内的细 胞物质及剩余的培养基残分等。 不管人们所需要的产物是胞内的还是胞外的或 是菌体本身，都首先要进行培养液的预处理和菌体 回收，只有将固，液分离开，才能从澄清的滤液中 采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出 发进行破碎、碎片分离和提取胞内产物。

  胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易失活。 特别是微生物细胞十分微小,细胞壁结构比较紧密,一 般方法不易将细胞打破,有些技术虽能,但条件严 苛,胞内生物活性物质在此条件下很易失活,限制了一 些技术的应用。 在某些特定的程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。

  通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击 而破碎，因此细胞破碎的阻力大多数来源于于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不一样生化物质其细胞 壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度 不同，细胞破碎的难易程度也就不同。 此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破 碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破 碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。

  聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺 （polyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在水中解离情况不同， 可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基） 三类。由于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm计量，絮凝 体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范 围广。 聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐 等。

  不同工艺路线对滤液要求不同 离子交换法：无机离子、灰分要求低 溶剂萃取法：要求蛋白质含量较低，减轻乳化 直接沉淀法：对滤液质量发展要求高，需反复过滤，结晶 前还要脱色处理。如四环类抗生素。

  高压匀浆器的操作温度上升约２－３℃/10MPa 为保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。 多组破碎操作中需要在级间设臵冷却装臵可有很大效果预防温 度上升，保护产物活性。

  利用细胞与玻璃小珠在搅拌桨作用下充分混合， 珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰 撞，促使细胞壁破裂。

  一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之 外的液相中（称胞外酶），这一些产品主要为医药和 保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位 成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培 养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固 －液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即 可。其后续分离和纯化都相对简单。

  ★但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构较为复杂，必须在 细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主 细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变， 此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应 用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液 相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准 备工作。

  细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细 胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放 出来的技术。

  （2）去除发酵液中部分杂质（可溶性胶状物质 和无机盐等），以利于后续各步操作。

  可溶性胶状物质：杂蛋白、核酸、不溶性多糖等，可 使溶液黏度增加，影响固液分离速度及后续操作（如 堵塞层析柱头）。

  它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭 窄的小孔，其大小能调节。 细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出 阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和 高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。 在操作方式上，能够使用单次通过匀浆器或多次循环 通过等方式，也可连续操作。 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度， 使出口温度调节在20℃左右。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓 度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方 法。

  变性蛋白质的溶解度较小，而产生沉淀 加热：使蛋白质变性、凝聚，同时降低液体黏度，加快 过滤速度

  链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至 70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速 度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。 柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝 固和降低发酵液粘度，从而大幅度的提升了过滤速度。

  不溶性多糖会增大溶液黏度，使固液分离 困难，可加入淀粉酶进行水解，将发酵液中 多余淀粉水解。

  如四环素发酵液通过122型树脂，除去Fe3 ，同时也吸附色素， 提高滤液质量。

  凝聚和絮凝：均是破坏发酵液中胶体的稳定性， 增大颗粒尺寸，增大颗粒的沉降或浮选速率。

  （六）吸附 加入反应剂，相互反应生成沉淀，能吸附蛋白质和 菌体等胶粒，同时起助滤剂作用。

  如四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾 K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀，能将杂蛋白和菌体黏附而除 去。 在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者 本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子 吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。

  细菌细胞壁主要成分是肽聚糖 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组 成（20～80nm)，较难破碎。 革兰氏阴性菌的细胞壁的肽聚糖层较薄 （2～3nm)，还有两层外壁层。

  肽聚糖是难溶性的聚糖链 （glycan chain），借助 短肽交联而成的网状结构， 包围在细胞周围，使细胞 具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨 基酸组成，如L-丙氨酰-D谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨 酸。而且短肽中常有D-氨 基酸与二氨基庚二酸存在。

  去除Ca2，常用草酸钠或草酸，形成草酸钙沉淀 去除Mg2，可用草酸、磷酸盐、三聚磷酸钠等 去除Fe3，加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀

  1、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其 简要机理如何？ 2、除去发酵液中杂蛋白的常用方法有哪些？ 3、如何去除发酵液中的多糖、金属离子？ 4、凝聚和絮凝有哪些不同之处？

  发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的 表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主 要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通 常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电 引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正 离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电 层。 但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的 热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在 这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两 部分，在相距胶核表面约一个离子半径的stern 平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称 为吸附层或stern层；在stern平面以外，剩余 的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓 度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为 扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型。

  絮凝剂：天然或人工合成的有机高分子化合物，具长链 线状结构，易溶于水，有大量的活性基团。 吸附胶粒，产生架桥连接，形成粗大的絮凝团，有助于 过滤。 可与凝聚剂配合使用，提高絮凝效果。

  影响因素：（1）分子量：链越长，吸附架桥效果越好，但自身在水 中溶解度也降低。 （2）用量：增加用量，有助于架桥，但过多会引起吸附饱和，降低 絮凝效果。 （3）PH值：影响电离度，进而影响链的伸展形态。 （4）搅拌速度和时间 ：适当搅拌，可使絮凝剂迅速分散，但过快 会打碎絮凝团。

  二、稳定性  分离提取时，生物活性物质处于一直在变化之中， 可被细胞本身的酶所破坏，或为微生物所分解， 还可能在制备时受到pH值、酸、碱、温度、金 属离子、盐、机械搅拌等的作用。

  如青霉素稳定性较差，发酵液酸化pH需控制在4.8～5.2， 并且低温。 多粘菌素E稳定性较好，可在pH2.0、95℃处理，可提高 过滤速度。

  破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其 网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽 键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结 构就致密。

  霉菌细胞壁较厚，100～205nm，多数由几丁质 和葡聚糖构成。 酵母细胞壁主要成分是葡聚糖，还含有甘露糖、 蛋白质和几丁质。幼时较薄，以后逐渐变硬。 较革兰氏阳性菌的细胞壁更厚，更难破碎。 藻类的细胞壁很复杂，主要结构是纤维状的 多糖物质。其强度取决于聚合物网状结构的交 联程度。

  天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚糖类，还有明胶、 骨胶、海藻酸钠等。

  微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，它是一类由微生 物产生的具有絮凝细胞功能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、 纤维素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合 成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。

  水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在 同心轴上的园盘搅拌器非常快速地旋转，使细 胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的 破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的 滚动而引起。 在料液出口处，旋转园盘和出口平板之 间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不 被料液带出。 由于操作的流程中会产生热量，易造成某 些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹 套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。

  酸性溶液中：蛋白质能与阴离子成盐形成沉淀，如三 氯乙酸盐、水杨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐等。 碱性溶液中：蛋白质能与阳离子形成沉淀，如Ag、 Cu2、Zn2、Fe3、Pb2等。

  可使细胞、细胞碎片及蛋白质等胶体颗粒去除。 凝聚：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层 的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使 胶体粒子聚集的过程。 胶体稳定的因素：电荷、水化层 电解质能中和电荷、破坏水化层 与蛋白质盐析的机理相同。

  细胞种类、生长环境、生长速率和产物位臵对 操作条件的影响 大肠杆菌较酵母易破碎 生长在复杂培养基的大肠杆菌比生长在合成培 养基中的大肠杆菌难破碎 非结合酶处理一次即可（压力54.5MPa，菌体 浓度10%～20%），膜结合酶则需3次破碎。 大肠杆菌的破碎效果随生长速率的减少而降低。

  发酵（培养）结束后，首先将菌体或细胞、固 态培养基等固态悬浮颗粒与可溶性组分分离， 即固液分离。 如固态悬浮颗粒较粗大，可直接进行。 如固态悬浮颗粒较细小，应先进行预处理。 如产物在胞内，还应先进行细胞破碎。

  影响细胞破碎的重要的因素：压力、循环次数、温 度。 操作压力：50～70MPa，一般为55MPa 一次破碎率：12%～67%，达到90%要多次 提高操作压力，有利于破碎，减少循环次数 温度由5℃提高到30℃，酵母破碎率提高1.5倍 适用于酵母和大多数细菌的破碎。 不适用于高度分枝的微生物，因为会堵塞阀。